母—胎界面RANKL/RANK信息传递对蜕膜巨噬细胞表型及功能的调节作用

【摘要】正常妊娠类似于同种异体移植,携有父系抗原的胚胎在母体内存活直至分娩,实际上是母体对胎儿的免疫耐受；若母体对胎儿发生免疫排斥,则导致妊娠失败,提示母-胎免疫耐受机制在正常妊娠过程中发挥重要作用。阐明这种免疫耐受机制,不仅对生殖免疫,而且对肿瘤免疫及自身免疫病研究均有积极意义。母-胎界面主要包括蜕膜基质细胞、滋养细胞及蜕膜免疫活性细胞,其中蜕膜基质细胞及蜕膜免疫细胞来源于母体,而滋养细胞则来源于胎儿,它们之间相互作用,共同参与维持母-胎界面Th2型免疫偏移。其中蜕膜巨噬细胞占蜕膜免疫活性细胞的10%,可参与胚胎植入、胎盘发育及宫颈成熟等生理过程,以维持成功妊娠。核因子NF-κB受体活化因子的配体RANKL(又称为TNFSF11,OPGL,TRANCE或ODF),属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员,与受体RANK及诱饵受体骨保护素OPG进行相互调控,参与破骨细胞的分化及骨重塑过程。RANKL/RANK在免疫系统亦发挥作用,RANKL及RANK基因突变的小鼠表现为淋巴结缺如,RANKL可促进树突状细胞(DC)的存活,诱导T细胞增殖等作用。母-胎界面存在多种免疫活性细胞,但迄今仍不清楚RANKL在母-胎界面是否发挥作用。第一部分RANKL参与调控蜕膜基质细胞及滋养细胞的生物学行为目的分析RNAKL在人早孕期蜕膜基质细胞及滋养细胞的表达及其调节作用。方法收集人早孕期正常的绒毛与蜕膜组织,应用胰酶消化、密度梯度离心法分离、培养正常人早孕期滋养细胞和蜕膜基质细胞(DSCs)。采用RT-PCR、免疫组织化学、流式细胞术,分别检测RANKL在母胎界面的表达。不同浓度的RANKL作用48h后,利用BrdU细胞增殖试剂盒检测蜕膜基质细胞及滋养细胞的增殖能力；采用AnnexinV-FITC/PI检测蜕膜基质细胞的凋亡；及利用Transwell检测滋养细胞的侵袭能力。结果RT-PCR、免疫组化及流式细胞术研究发现,人早孕期蜕膜基质细胞共表达RANKL及其受体RANK;RT-PCR,免疫组化及流式细胞术分析发现,滋养细胞也共表达RANKL及其受体RANK。RANKL以浓度依赖的方式促进蜕膜基质细胞及滋养细胞的增殖：RANKL(100ng/ml)明显抑制蜕膜基质细胞的凋亡：RANKL(100ng/ml)显著促进滋养细胞侵袭。结论RANKL以自分泌方式促进蜕膜基质细胞的增殖,抑制其凋亡；RANKL以自分泌方式促进滋养细胞增殖与侵袭。第二部分RANKL参与调节蜕膜巨噬细胞的功能及表型目的解析母胎界面的RANKL对蜕膜巨噬细胞功能及表型的调节作用。方法利用流式细胞术分析各种蜕膜免疫活性细胞RANK表达水平；比较外周单核细胞与蜕膜巨噬细胞RANK表达水平；根据RANK在巨噬细胞表达与否,区分为RANK+dMφ与RANK-dMφ两个细胞亚群,进而分析两个细胞亚群的表型差异；免疫磁珠分选蜕膜巨噬细胞,得到较高纯度的巨噬细胞。将蜕膜基质细胞、滋养细胞及蜕膜巨噬细胞共培养,并在其共培养体系加入rhOPG及anti-RANKL中和性抗体作用48h后,流式细胞术分析蜕膜巨噬细胞表面协同刺激分子CD80.CD86的表达;ELISA检测蜕膜巨噬细胞分泌IL-10、IL-12及IL-23的水平。经过蜕膜基质细胞及滋养细胞的RANKL训导蜕膜巨噬细胞与同种蜕膜naiveT细胞共培养5d后,Bioplex检测IL-4、IL-10、TNF-α及IFN-γ的分泌水平。结果流式细胞术分析发现,蜕膜巨噬细胞表面表达较高水平的RANK,并且RANK在蜕膜局巨噬细胞的表达水平明显高于外周单核细胞。与RANK-dMφ比较,RANK+dMφ表面表达较高水平的CD206、CD209及CD11c,表现为M2型,即耐受型巨噬细胞。滋养细胞及蜕膜基质细胞来源的RANKL降调节蜕膜巨噬细胞表面协同刺激分子CD8、CD86的表达水平；促进蜕膜巨噬细胞分泌IL-10,抑制分泌IL-12、IL-23。被蜕膜基质细胞及滋养细胞训导的蜕膜巨噬细胞可诱导蜕膜naiveT细胞分泌高水平的IL-4、IL-10,并抑制]NF-α及IFN-γ的分泌。结论RANK+dMcp表面表达较高水平的CD206、CD209及CD11c,呈现为M2耐受型巨噬细胞；蜕膜基质细胞及滋养细胞来源的RANKL可诱导蜕膜巨噬细胞分化为M2型巨噬细胞;经过蜕膜基质细胞及滋养细胞表达的RANKL训导蜕膜巨噬细胞可介导同种蜕膜naiveT细胞分化为Th2型细胞,使母-胎界面呈现Th2型免疫优势。第三部分RANKL调控蜕膜巨噬细胞表型的分子机制目的解析RANKL调控蜕膜巨噬细胞功能及表型的分子机制。方法将滋养细胞、蜕膜基质细胞与蜕膜巨噬细胞共培养,并在共培养体系中加入rhOPG或anti-RANKL中和性抗体处理后,利用Phosflow流式细胞术检测蜕膜巨噬细胞活化的信号通路如PI3k/Akt、STAT6等；采用实时定量real-timeRT-PCR检测共培养后蜕膜巨噬细胞转录因子IRF4、Jmjd3的表达；利用质粒pCDNA3.1(+)-RANKL过表达蜕膜基质细胞及滋养细胞肿瘤细胞系JEG-3细胞,成功实现蜕膜基质细胞及滋养细胞过表达RANKL.蜕膜基质细胞及JEG-3细胞过表达RANKL后,与蜕膜基质细胞共培养,并在共培养体系中加入PI3K/Akt特异性抑制剂Ly294002,ELISA检测IL-10、IL-12及IL-23的分泌水平；real-timeRT-PCR检测巨噬细胞表型相关转录因子IRF4、Jmjd3mRNA的表达。结果滋养细胞及蜕膜基质细胞与蜕膜巨噬细胞共培养后,RANKL通过与蜕膜巨噬细胞表面的RANK结合,激活Akt(pS473)分子,进而活化下游STAT6分子,启动M2型巨噬细胞相关转录因子IRF4、Jmjd3mRNA的转录,使巨噬细胞表现为M2巨噬细胞表型。蜕膜基质细胞及JEG-3细胞过表达RANKL后,可活化巨噬细胞PI3K/Akt信号通路,促进IRF4、Jmjd3mRNA的转录,增加IL-10的分泌。结论蜕膜基质细胞及滋养细胞来源的RANKL通过活化PI3K/Akt信号分子,进而活化STAT6分子,促进M2型巨噬细胞相关转录因子IRF4、Jmjd3mRNA的转录,诱导蜕膜巨噬细胞向M2耐受型巨噬细胞分化。第四部分母-胎界面RNA1KL表达下降导致巨噬细胞M1型偏移及自然流产目的利用动物实验验证母-胎界面RANKL表达异常对蜕膜巨噬细胞功能及妊娠结局的作用。方法建立正常妊娠小鼠模型及自然流产小鼠模型,在小鼠孕5天及孕9天原代分离得到小鼠蜕膜免疫活性细胞,利用流式细胞术分别分析孕5天及孕9天小鼠蜕膜巨噬细胞RANK表达水平；并分析正常妊娠小鼠及流产小鼠蜕膜巨噬细胞表面CD80、CD86、CD206及MHC-II类分子的表达水平。在正常妊娠小鼠孕3天时给予手术处理,分别给予宫角注射anti-RANKL中和性抗体及抑制剂Ly294002,术后4天观察小鼠胚胎吸收率,流式细胞术分析两侧子宫蜕膜巨噬细胞表面CD80、CD86、CD206及MHC-Ⅱ类分子的表达情况。结果孕5天时,正常妊娠小鼠蜕膜巨噬细胞表面RANK的表达明显高于流产小鼠;孕9天,正常妊娠小鼠蜕膜巨噬细胞表面RANK的表达仍明显高于流产小鼠。孕9天,流产小鼠蜕膜巨噬细胞表面MHC-Ⅱ类分子显著高于正常妊娠孕鼠,但协同刺激分子CD80、CD86无明显差异。在正常妊娠孕鼠,anti-RANKL中和性抗体处理,4天后一侧子宫蜕膜巨噬细胞表达CD80、CD86的水平明显高于对侧vector处理组。anti-RANKL中和性抗体处理组的胚胎吸收率均明显高于vector处理组。结论母-胎界面RANKL降调节可导致蜕膜巨噬细胞分化为M1型及不良妊娠结局。综上所述,本研究发现人早孕期蜕膜基质细胞及滋养细胞表达RANKL及其受体RANK,并在母-胎界面发挥以下作用：(1)RANKL以自分泌方式促进蜕膜基质细胞增殖,抑制其凋亡；(2)RANKL促进滋养细胞增殖与侵袭；(3)蜕膜基质细胞及滋养细胞来源的RANKL抑制蜕膜巨噬细胞表达CD80、CD86,促进IL-10的分泌,抑制IL-12、IL-23的分泌,表现为M2耐受型巨噬细胞；(4)经过蜕膜基质细胞及滋养细胞来源的RANKL训导的蜕膜巨噬细胞,可诱导蜕膜naiveT细胞分化为Th2型,利于母-胎界面形成Th2型免疫优势；(5)蜕膜基质细胞及滋养细胞来源的RANKL通过活化蜕膜巨噬细胞内PI3K/Akt及STAT6信号通路,促进M2型巨噬细胞转录因子IRF4、Jmjd3mRNA的表达,调节蜕膜巨噬细胞的表型；(6)母-胎界面RANKL降调节,则导致蜕膜巨噬细胞向M1型分化及自然流产的发生。因此,母-胎界面的RANKL作用于蜕膜巨噬细胞,在母-胎界面产生利于妊娠的免疫耐受微环境。
【作者】孟玉菡；
【导师】李大金；
【作者基本信息】复旦大学，妇产科学，2013，博士
【关键词】RANKL；RANK；蜕膜基质细胞；滋养细胞；蜕膜巨噬细胞(dMψ)；CD80；CD86；蜕膜naiveT细胞；PI3K/Akt；IRF4；Jmjd3；自然流产；

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